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cKI小鼠模型構(gòu)建

cKI小鼠模型構(gòu)建

簡(jiǎn)要描述:
cKI小鼠模型構(gòu)建:構(gòu)建 cKI(條件性基因敲入,Conditional Knock-In)小鼠模型 是研究基因功能、疾病機(jī)制或藥物靶點(diǎn)驗(yàn)證的重要工具,尤其適用于需要在特定組織(如心臟)或時(shí)間點(diǎn)精確調(diào)控基因表達(dá)的研究

更新時(shí)間:2025-06-26

訪問(wèn)量:243

廠商性質(zhì):其他

1. cKI小鼠模型構(gòu)建策略選擇

A. 核心元件設(shè)計(jì)

  1. 目標(biāo)基因(GOI, Gene of Interest)

    • 將外源基因(如報(bào)告基因、突變基因或熒光蛋白)插入內(nèi)源基因位點(diǎn),或替換特定外顯子。

  2. 條件性調(diào)控系統(tǒng)

    • Cre-loxP系統(tǒng):通過(guò)組織特異性Cre重組酶實(shí)現(xiàn)條件性激活。

    • FLEx(Flip-Excision)系統(tǒng):結(jié)合Flp-FRT和Cre-loxP實(shí)現(xiàn)多重調(diào)控。

    • 誘導(dǎo)型系統(tǒng)(如Tet-on/off、他莫xi芬誘導(dǎo)的Cre-ERT2)。

B. 心臟特異性cKI常用工具

  • 啟動(dòng)子:αMHC(Myh6)、cT*T(Tnnt2)驅(qū)動(dòng)Cre表達(dá)。

  • 報(bào)告基因:如tdTomato(loxP-stop-loxP-tdTomato)用于追蹤表達(dá)。


2. cKI小鼠模型構(gòu)建技術(shù)流程

A. 載體設(shè)計(jì)

  1. 靶位點(diǎn)選擇

    • 安全港位點(diǎn)(如Rosa26、H11)或內(nèi)源基因位點(diǎn)(需同源重組)。

    • 避免干擾鄰近基因(需UCSC基因組瀏覽器分析)。

  2. 條件性敲入結(jié)構(gòu)(以Rosa26-loxP-STOP-loxP-GOI為例):

    • 5'同源臂 + loxP-STOP-loxP + GOI + 3'同源臂 + 篩選標(biāo)記(如Neo)。

B. 基因編輯方法

  1. CRISPR-Cas9介導(dǎo)的KI

    • 設(shè)計(jì)sgRNA靶向插入位點(diǎn),與供體載體共注射至受精卵。

    • 供體載體:包含同源臂和條件性表達(dá)盒(如圖1)。

  2. ES細(xì)胞打靶(傳統(tǒng)方法)

    • 電轉(zhuǎn)ES細(xì)胞后篩選陽(yáng)性克隆,顯微注射至囊胚。

C. 小鼠品系建立

  1. Founder小鼠鑒定

    • PCR或Southern blot驗(yàn)證正確整合。

  2. 與Cre品系交配

    • 例如:Rosa26-lsl-GOI × αMHC-Cre → 心臟特異性GOI表達(dá)。


3. 驗(yàn)證與表型分析

A. 基因型驗(yàn)證

  • PCR:檢測(cè)loxP位點(diǎn)、GOI插入及Cre重組效率。

  • 測(cè)序:確認(rèn)無(wú)脫靶突變。

B. 表達(dá)驗(yàn)證

  • qRT-PCR/Western blot:檢測(cè)GOI在心臟中的表達(dá)水平。

  • 免疫熒光/組織染色:定位GOI表達(dá)(如tdTomato熒光)。

C. 功能表型

  • 心臟功能:超聲心動(dòng)圖(EF%、FS%)、心電圖(心律失常)。

  • 病理分析:心肌纖維化(Masson)、 hypertrophy(WGA染色)。


4. 常見(jiàn)問(wèn)題與優(yōu)化

A. 低重組效率

  • 解決:優(yōu)化Cre品系(如高表達(dá)αMHC-Cre)或使用誘導(dǎo)型Cre(他mo昔芬)。

B. 背景泄漏表達(dá)

  • 優(yōu)化:加強(qiáng)STOP序列(如三重polyA信號(hào))或選擇更嚴(yán)格的啟動(dòng)子。

C. 脫靶效應(yīng)

  • 解決:全基因組測(cè)序(WGS)篩選Founder小鼠。


5. 應(yīng)用示例

案例1:心臟特異性表達(dá)熒光報(bào)告基因

  • 構(gòu)建:Rosa26-lsl-tdTomato × αMHC-Cre → 心肌細(xì)胞紅色熒光標(biāo)記。

  • 用途:追蹤心肌細(xì)胞譜系或移植細(xì)胞命運(yùn)。

案例2:條件性激活突變基因

  • 構(gòu)建:Knock-in loxP-STOP-loxP-mutant-Kras × cT*T-Cre → 心肌特異性致癌突變模型。


6. 注意事項(xiàng)

  1. 對(duì)照設(shè)計(jì)

    • 必須包括:無(wú)Cre的GOI小鼠(loxP-STOP-loxP-GOI)、Cre單獨(dú)表達(dá)小鼠。

  2. 時(shí)間控制

    • 誘導(dǎo)型Cre(如Cre-ERT2)需優(yōu)化他mi昔芬劑量和時(shí)間窗口。

  3. 倫理與標(biāo)準(zhǔn)化

    • 遵循ARRIVE指南,確保動(dòng)物福利和實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性。



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